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实验笔记丨CRISPR-dCas9实验步骤详解

载体酶切 准备灭菌的PCR离心管，配制酶切体系，放置PCR仪，孵育3小时，终止酶切后使用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。琼脂糖凝胶DNA回收 将吸附柱置于收集管中，加入Buffer BL，离心活化硅胶膜；在紫外灯下，用刀片切下目的条带，尽量去除非目的DNA，确保体积最小。

设计sgRNA 构建sgRNA-Cas9载体 构建sgRNA-Cas9稳转株 4 .筛细胞克隆并进行qPCR验证 5 .阳性克隆测序，选择敲除纯合细胞株 6 .筛选细胞单克隆测序 实验步骤：设计sgRNA 针对小鼠LIF基因座（Musmusculus，NM_008501）设计了三种sgRNA。进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。

sgRNA设计流程包括以下原则： sgRNA长度：SpCas9一般为20nt。 sgRNA序列碱基组成：基因特异的sgRNA模板序列位于PAM序列前，PAM序列特征为NGG （N为任意核苷酸），选择3末端含有GG的sgRNA，可构成PAM序列。sgRNA序列应避免以4个以上的T结尾，GC含量最佳为30%-70%（40%-60%）。

实验流程介绍 天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成：SpCas9 （简称Cas9）、crRNA、tracrRNA。tracrRNA（在CRISPR-Cas9编辑技术中被优化并命名为gRNA scaffold），它负责与Cas9结合，与重复序列具有同源性。crRNA为引导序列，约20个碱基，具有特异性。

手机通过蓝牙和电脑连接后能否实现共享上网?

手机打开蓝牙 1 手机打开设置，往下滑动页面，点击【更多设置】。电脑如何通过蓝牙连接共享手机的网络？2 进入更多设置页面，点击【蓝牙】。电脑如何通过蓝牙连接共享手机的网络？3 进入蓝牙页面，打开【蓝牙】。

首先在手机里面打开移动共享网络。在移动共享网络里面蓝牙设备共享网络打开。然后在电脑里面连接局域网。连接成功以后就可以在电脑里面上网了。

确实可以利用电脑的蓝牙功能将网络共享给手机，实现这一操作需要遵循以下步骤：首先，在手机端进行如下设置：同时开启手机和笔记本电脑的蓝牙功能，并完成二者之间的配对连接。在成功配对之后，进入手机的“设置”菜单，依次点击“无线和网络”和“更多”选项，然后开启“蓝牙共享网络”功能。

如果电脑没有内置蓝牙，可以通过购买绿联USB蓝牙0适配器来实现。连接适配器后，按照适配器说明书安装驱动程序，确保电脑蓝牙功能正常工作。第二步，手机通过移动热点和网络共享选项，打开蓝牙网络共享。

电脑有蓝牙的情况下才可以用蓝牙共享；首先手机开启蜂窝数据，关闭WiFi，开启热点和蓝牙，用电脑连接手机蓝牙，一般都是在“开启热点”的设置界面里面选择通过蓝牙共享数据网络。

京东白号怎么黑了

1、“如果发生京东账号领不了优惠券的情况，排除网络和京东系统正常的情况的话，大概率可能被黑号了。”小黑号已经开始进入京东黑名单了。主要表现形式为抢不到全品券，第三方辣鸡券输入验证码可以拿到。然后除了会员签到和京豆签到，任何地方得不到签到京豆。严重一点会导致抢购失败，就是秒杀全部不能下单。

2、和客服交涉被黑的 我被京东黑了两个账号，都是送来的书有破损，我去交涉，没换货赔了点钱了事。完全无拆单无拒收。

3、京东白号即安全账号，也就是京东账户没有出现违规的行为，状态一直正常。如果京东账户批量进行注册，这时注册的账户都是黑号，黑号在使用时某些功能会受到限制。所以，用户在平时要使用白号，不能使用黑号。

4、想要查询京东平台上的黑号或白号，可以访问慢慢买网站。在该网站上，有一篇文章详细整理了如何识别这些账户。文章中特别强调，如果能够准确把握识别尺度，那么在慢慢买省钱控平台上看到的优惠信息是安全可靠的。这是关键点之一。京东平台上存在一些被标记为黑号的账户，这些账户通常会引发一系列问题。

5、京东黑号怎么恢复白号？找客服，直接说明原因，最好能配一些图片，证明帐号确实有问题，当然这只适合一般代下比较少的用户，如果多了，基本不要找了，客户会直接告诉你，说最近下单异常，尽量少下一些不同地址的订单，基本上白不了了。

如何把淘宝的黑号变白号了?

商家需要详细查看淘宝规定，找出可能触发黑号的违规行为，并进行整改。提供证明材料： 商家可以准备相关证明材料，如商品真实性证明、售后服务证明等，向淘宝客服提交，以证明自己的经营行为是合法的。与客服沟通： 主动与淘宝客服取得联系，说明整改情况，提供证明材料，并请客服协助尽快解封账号。

淘宝黑号变白的方法并不固定，因为淘宝的系统算法和规则随时在变化。但通常，要洗白一个淘宝黑号，用户需要改善自己在淘宝平台上的行为，提升信用度，并尝试与淘宝客服沟通解决问题。以下是一些建议性的步骤：首先，用户应该检查自己是否存在违规行为。

淘宝黑号转白号的方法其实挺简单的，就是不要参加或者违法活动，然后正常购物，一年之内就可以转白。淘宝黑号官方是没有具体规定的，如果想要恢复需要一系列操作，一般情况下黑号是无法进行恢复的。淘宝变成黑号后，无法领取优惠券，秒杀活动也无法参加，积分也会变得比较少。